Para ver proteínas en multicolor los anticuerpos son lo mejor

Diferentes células del  Sistema Nervioso Central de rata.
Foto: T.Rusielewicz y C. Meléndez-Vásquez 

Seguro que muchos de vosotros habeís visto fotos espectaculares de células en colores como la de la derecha. Estas fotos pueden ser de cualquier tipo de célula aunque como este año se celebra el año internacional de la Neurociencia las que os voy a mostrar en este artículo serán todas células del sistema nervioso. 

Lo primero de todo deciros que lo que veis en estas fotos son proteínas que están dentro de las células. En el caso de esta primera foto lo que veis en verde es la proteína actina, en rojo se ve la tubulina y en azul principalmente una proteína llamada RIP, que es específica de oligodendrocitos (un tipo específico de células del Sistema Nervioso Central). El resultado es fantástico y no solo eso, sino que el poder ver dónde están las proteínas dentro de las células ayuda a conocer cómo funcionan y qué efectos tienen algunas alteraciones que ocurren en las células (como por ejemplo las alteraciones que se producen en muchas enfermedades).

Una de las técnicas más comunes que se utilizan para ver las proteínas dentro de las células es la inmunofluorescencia. Además se puede utilizar en prácticamente todo tipo de células, ya sean de levaduras, de animales o de humanos. Es una técnica que me gusta mucho por las imágenes tan bonitas que se obtienen pero que lleva su tiempo y sus pasos. Sí, hoy he sacado este tema porque últimamente es casi lo único que hago en el laboratorio... y hasta sueño con las imágenes resultantes :-)

Ganglio con nervios sensoriales. Foto: S. Beggs (Wellcome Images)

Lo fundamental de la inmunofluorescencia es que utiliza anticuerpos para "ver" las proteínas. La idea que tenemos de los anticuerpos es que son moléculas que nos defienden de otras moléculas extrañas para el organismo. Basado en el mismo principio que utilizan para llevar a cabo esta función es cómo actúan en esta técnica. Los anticuerpos reconocen proteínas específicas. Es decir, que diferentes anticuerpos "verán" y se unirán a diferentes proteínas. Cada uno a una específica. Así, si conseguimos producir un anticuerpo que vea a la proteína actina (del ejemplo de la foto de arriba) éste se unirá a ella. Si a este anticuerpo le unimos una molécula que emita una luz cuando se la excita con una longitud de onda determinada (llamada también fluorocromo) y lo ponemos en la célula el resultado os lo podeis imaginar. El anticuerpo se unirá a la actina allí donde ésta esté y si ponemos esa célula debajo de un microscopio y la iluminamos con la luz de la longitud de onda adecuada para ese fluorocromo... ¡¡tachán!! seremos capaces de ver dónde está la actina. 

Por desgracia los anticuerpos con fluorocromos son bastante caros así que normalmente no hacemos las inmunofluorescencias exáctamente de esa forma. Lo que generalmente se hace es tener anticuerpos normales, que son específicos para diferentes proteínas pero que han sido producidos en diferentes animales, como ratones, ovejas o conejos. Los anticuerpos producidos en cada uno de estos animales tienen una parte que es común y específica para cada animal. Esto se aprovecha para crear los anticuerpos con fluorocromos que vean, en vez de proteínas específicas, los anticuerpos que han sido producidos en un animal en concreto. De esta manera podemos tener muchos anticuerpos que reconocen proteínas expecíficas, pero sólo necesitaremos tres tipos de anticuerpos con fluorocromos (uno para los anticuerpos que se ha producido en ratón, otro para los que se han producido en oveja y otro para los que se han producido en conejo) aunque luego tengamos varios de cada clase unidos a diferentes fluorocromos que nos darán diferentes colores.

Pero no todo es tan sencillo como parece. Para que los anticuerpos puedan unirse a las proteínas primero tienen que ser capaces de entrar en las células. Por eso, lo primero que hacemos cuando queremos llevar a cabo una inmunofluorescencia es "fijar" las células. Sí, sí. Fijar las células. Parar las células. Hacer que todo lo que esté ocurriendo en esas células en un momento determinado se quede como está y no se mueva. De esta forma podemos después tratarlas para abrir pequeños agujeritos en sus membranas y que los anticuerpos puedan entrar en ellas. 

Neuronas de un ganglio.
Foto: K. Nobes y M. Shipman (Wellcome Images)

Fijar las células es todo un arte porque hay diferentes métodos y diferentes compuestos para hacerlo. La elección del compuesto o compuestos y de la cantidad de los mismos dependerá de las proteínas que queramos ver y los anticuerpos que queramos utilizar y lleva su tiempo el conseguir la adecuada fijación. Poca fijación y no verás nada. Mucha fijación y te cargarás las estructuras moleculares de la células.

Lo que hacen los fijadores es crear "puentes" o uniones entre las proteínas para que no se muevan ni se modifiquen. Algunos de los químicos que se utilizan más comúnmente son ciertos aldehidos cuyos grupos -CHO ("grupo aldehido", característico de estos compuestos y que les da su nombre) reaccionan con los grupos -NH2 que tienen algunos de los aminoácidos que forman las proteínas. De esta forma cadenas largas de aldehídos (con muchos grupos -CHO) podrán reaccionar con muchos aminoácidos formando esos puentes entre proteínas y conservando su estructura tal cual. Dos aldehídos muy utilizados son el glutaraldehido y el formaldehido. Estos son lo que normalmente utilizo para mis experimentos, a veces solos, a veces en combinación, y que dan unos resultados preciosos y muy valiosos para mis investigaciones.

Sin embargo uno de los problemas de esta técnica es que no la podemos utilizar para ver células vivas. Para eso se utilizan otras técnicas. De hecho se han desarrollado múltiples técnicas para la visualización de las proteínas dentro de las células en muy diversas condiciones y con diferentes resultados. Pero eso ya sería tema para otro artículo. De momento os dejo con un video que combina la inmunofluorescencia con un interesante método de capturar imágenes y en el que podéis ver una reconstrucción visual de las sinapsis de una parte de la corteza cerebral de ratón. Espero que os guste.

Esta entrada participa en el XI Carnaval de Biología hospedado en el blog "Ciencia y alguna otra cosa", en el XIII Carnaval de Química hospedado en el blog "Curiosidades de un químico soñador" y en el VIII Carnaval de la Tecnología hospedado en el blog "Los productos naturales, ¡vaya timo!".